りあるたいむ100。 これでもう失敗しない!リアルタイムPCRに失敗する4つの問題点と解決策をご紹介

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臨床検査に遺伝子検査が導入され、その複数項目に保険点数が認可されたのは比較的新しい。 遺伝子検査は、高い特異性、高感度、迅速および簡易というキャッチフレーズの下に飛躍的な普及を遂げてきた。 個別的には、確かに有用性の高い特性を持つ分析法といえるが、別の角度からみると、微生物の頻繁な遺伝子変異への対応、微小癌における微量変異遺伝子への対処、増幅産物汚染対策および増幅阻害など留意すべき課題もある。 また、遺伝子検査は検査技師の世代間により受講教育内容に大きな格差がある。 高齢の人は、遺伝子講義の内容および時間数ともに比較的乏しいが、近年卒業された人は、多くの遺伝子理論と実技などを習得し、さらには院生として修学された人も増加傾向にある。 このことは他の検査部門においても同様であるが、遺伝子検査での傾向は顕著である。 近年では、安価で簡易な解説書やネット情報なども入手しやすく、各人が興味を持てば学習可能な機会は増えている。 しかし、現実的には、検査業務の膨大化とともに検査業務以外の作業が増大化しており、じっくりと学習できる時間は乏しいように見受けられる。 さらに、書籍も遺伝子検査と直接的には関連しない難解な遺伝情報の解説が多く、肝心な遺伝子検査に限局した基礎を書きためたものは比較的少ない。 本稿では、PCR(polymerase chain reaction)を中心に遺伝子増幅検査の経験が乏しい、もしくは経験がなく、これからPCRを始めたい方々を対象に『これからPCR検査を始めたい方への基礎知識』を、続編としてすでに遺伝子検査を経験されている方々を対象に『いまさら、でも大切な遺伝子検査の基礎をふり返る』との2編に分け、遺伝子検査における基礎的課題を紹介する。 本稿では、用途別に分かれる「遺伝子抽出法」と「プライマー設計法」は除外した。 また、試薬・器具類は具体的な商品名を挙げたが、これは取り掛かりやすいように使用経験上から製品例を挙げたものであり、ベストとの意味ではない。 また本稿は、構成要素が多岐に渡ったため、読者の方が適宜分割して小休止しながらお目通しいただきたい。 1:遺伝子増幅の目的 PCRによる遺伝子増幅を確立するまでの概要と手順を図1にまとめたが、目的に合致する方法を確立するまでは、多くの要因の検証と確立および関連する知識とが求められる。 また、これらは概要別に順を追って進める方が成功率は高い。 本稿でもこの手順に沿って展開したい。 図1 PCR法による遺伝子増幅検査確立までの概要と手順 遺伝子の増幅にはいくつかの目的がある。 すなわち、 1 遺伝子存在の有無を検出することが目的で、目視もしくは検出機器での検出可能なレベルまで増幅する。 2 遺伝子増幅領域のDNAシーケンス解析により、被験遺伝子の検証もしくはDNA塩基変異の有無を調べる。 3 増幅遺伝子をベクターに挿入し形質転換に用いる。 などがある。 また、この目的により増幅遺伝子の鎖長など、その制約も変わってくる。 他には、増幅時に標識塩基や標識プライマーなどを活用し、標識増幅産物を作成することなどもある。 PCRは、DNAポリメラーゼ酵素を用いて、鋳型(template)二本鎖DNAのセンスおよびアンチセンス鎖にアニールした一対のプライマー間を in vitroで複製する酵素反応である。 従って、初心者でも基本理論を理解していれば比較的容易に目的遺伝子のDNA断片を増幅できる。 さらに、理論的な机上構想に委ねられる因子も多いという特徴を持っている。 増幅反応に求めるものとしては、収量、特異性、複製の正確性(fidelity)、増幅産物の鎖長などがある。 これらに関与する因子としては、反応液の塩濃度、基質濃度、緩衝剤、使用酵素、添加剤、プライマー構成など反応を大きく左右するものが多く、目的を明確化すると同時に、最適な構成試薬を選択し、その増幅条件を設定する必要がある。 近年、PCRはend-point PCR、real-time PCRおよびdigital PCRなどいくつかに大別されている。 そのほとんどが専用機器を用いた閉鎖反応系であり、遺伝子検査における重要な課題である、「増幅産物のキャリーオーバーによる汚染」対策が講じられてきたが、分析機器は高額なため導入できる施設は限られる。 従って、多くの施設や多くの分野で、汚染防止に留意しながら、簡易かつ的確に目視結果が得られる増幅産物のアガロースゲル電気泳動による分析を行っている。 早期に遺伝子分析およびDNA増幅法として確立したPCRは、増幅の条件設定が比較的簡易で、かつ増幅後のアプリケーションも多彩なため広範囲な分野で活用されている。 増幅は目的DNA上に設定した一対のプライマー間を挟んだ鋳型DNA領域を増幅する。 増幅は、理論上は1サイクルごとに倍、倍で増幅し、30サイクルで一つの鋳型DNAからおよそ10億コピーの増幅産物が産生される。 さらに、PCR検査のなかには、鋳型DNAをバイサルファイト処理しCpGアイランドのメチル化DNAを調べるメチル化試験もある。 これは、バイサルファイト処理により、メチル化シトシンはそのまま、非メチル化シトシンはウラシルに変換する化学反応を用いたもので、これをPCR増幅により検証する。 このように、PCRは単に遺伝子を増幅検出するだけでなく、種々の遺伝子機能を分析評価する手法にも応用される。 増幅目的を明確化した上での方法選択は必須であり、漠然と遺伝子検査を行うだけでは、その特質を活かせず課題も見えてこない。 2:DNA増幅反応の方向性 DNAの構造については詳細に説明した総説や教科書が多いので、それらを参照していただきたい。 図2 2本鎖鋳型DNA(テンプレート)と熱変性により1本鎖DNAとプライマー接合と伸長反応の模式図 さらにDNAの方向性で重要なものには、Exonuclease活性がある。 従って、忠実度の高い長い鎖長の増幅に適している。 Exonuclease活性の有無は、試薬説明書に明記されている。 3:遺伝子配列情報 分析対象の遺伝子配列情報は、PCR条件の構築後は必須ではないが、分析上のトラブルや異常反応に対処できるように手元に持っておくほうが便利である。 プライマーを文献や資料などから引用した場合は特にDNAシーケンスの検証や遺伝子内のプライマーサイトを確認することは大切である。 この遺伝子情報を入手するには、NCBI のGeneから検索する方法や、NCBI GenBank に直接アクセスする方法がある。 また、Accession Number(登録番号)がわかっている場合は直接検索できる(図3)。 図3 Accession Number (登録番号)からの直接検索 細菌の抗生物質耐性遺伝子Carbapenemase「bla OXA-48」の検索を例示すると、NCBI GenBankのGeneを選択し、「bla OXA-48」と入力し検索する。 類語などを含む検索結果が表示される。 この情報の最下部にアミノ酸シーケンスと798bpの塩基シーケンスデータが記載されている(図4、図5、図6)。 図4 NCBI Gene から「bla OXA-48」を検索 図5 NCBI Gene の「bla OXA-48 ID:13913776」を開きGenBankをクリック 図6 Klebsiella pneumoniae plasmid pOXA-48, complete sequenceデータ この情報を基にプライマーデザインやプライマーシーケンスの確認などを行う。 PCR成功の鍵はプライマー配列設計にあると言っても過言ではない。 また、増幅領域の塩基配列の構成に伴うPCR障害は後述するが、増幅障害などに対処する手段の選択に有益となる。 従って、PCR検査の経験が少ない方は、比較的熟慮された分析系である文献や資料などからプライマーを引用され、データベースとの検証に力点を置かれることをお勧めする。 この既定の3温度域(変性、アニーリング、伸長反応)を素早く加熱・冷却し、既定温度を保持し、さらに規定数までの反復を繰り返す機器がサーマルサイクラーである。 複製DNA(2本鎖)は、機器に設定したプログラムに沿って次のサイクルに入り、再度Denature, Annealing, Extensionを繰り返し1サイクルで2倍に増幅する。 PCRではこの操作を25~40サイクル繰り返す。 5Kbpと記載する。 ヒトゲノムのサイズは3Gbp(ギガベースペア、30億塩基対)、大腸菌ゲノムのサイズは4. 8Mbp(メガベースペア、480万塩基対)という言い方をする。 デオキシリボヌクレオチドの平均分子量はおよそ327であり、脱水重合で1塩基対あたり水2分子が抜けることなどを考慮すると、塩基対の大きさに616をかけることでおおよその分子量が求められる。 (Wikipedia「塩基対」より抜粋) 1 PCRサイクル 2 アニーリング 熱変性により1本鎖になった鋳型DNAにプライマーが接合し2本鎖を形成するプライミング反応を起こすステップであり、通常、アニーリング温度はプライマーのTm値以下に設定する。 アニーリング温度を下げ過ぎるとプライマーの非特異的なアニーリングが起きやすく、結果として非特異的増幅が増え、標的配列の増幅が阻害される。 アニーリング温度は高いほうがプライマーと鋳型DNAとのミスマッチが減少し反応の特異性が高くなる。 しかし、高過ぎると標的配列も増幅できなくなる。 フリーの計算ソフトも公開されている。 プライマーのTm値の計算には、「Nearest Neighbor法」を用いるのが良い。 5-9. 5)を保持するBufferが必要である。 また、カリウムイオンが酵素活性を高めるため50mM程度を添加する場合があるが75mM以上になると阻害する。 これらのPCRに必要な試薬(プライマーと鋳型DNAを除く)はすべて装備された試薬キットが市販されている。 さらに、近年は試薬類の操作が容易なように、反応に必要な成分などを混合したmaster mix濃縮液の形状でも市販されているが、個別の分別試薬もあるので組成や濃度変更が必要なときは活用する。 3 PCRに必要な機器 1 サーマルサイクラー PCRでは、変性温度、プライマーとのアニール温度、伸長反応温度の保持と3段階の温度が必要で、これらを1サイクルとした温度の上昇・下降を素早く移行するサーマルサイクラーが必要である。 DNAポリメラーゼの酵素特性を活かすためには機器の温度作動は急速さが求められる。 サーマルサイクラーは、サーモグラジェント機構を備え、一台で機能的には3~6反応系を同時に独立して進行可能な機種もある。 現在では、特殊機能を求めなければ50万円を切る機種も市販されている。 サーマルサイクラーは、サーマルブロックと呼ばれる金属板でプログラム通りに反応チューブを急速に加熱・冷却する機能を持つ。 金属板にはヒーターやペルチェ素子などがついており的確に反応液の温度を上下させる。 5:プライマー域の設定 プライマーはPCRの可否を左右する重要な因子である。 市販の既定品以外のプライマーは通常、塩基配列を記載し合成を依頼する。 類似したものにプライマーとプローブがある。 両者はいずれも鋳型DNAおよび複製DNAの1本鎖の相補的塩基部位にハイブリするオリゴ塩基である。 DNAのPCR増幅領域は、数塩基と短いものから数十キロ塩基と長いものまである。 また、遺伝子検査の目的によっては増幅領域内の1塩基の変異を検索するものや生物種間の塩基変異を検索する、もしくは遺伝子の欠損や挿入を検索するなど目的はさまざまである。 プライマー領域については、Tm値や塩基構成などの諸性質を調べるが増幅領域内部の調査は手薄なことが多い。 増幅領域のGC、ATの塩基構成は、PCRの条件設定、増幅酵素の選択、増幅反応液への添加試薬を決める重要な因子である。 これらの情報を基にたどれば最適なPCR条件や試薬選択の参考となる情報チャートが各試薬メーカーより提供されている。 本稿では、プライマー設計については言及しないが、異なる複数のプライマー資料を入手しその選択に迷った場合を想定し、プライマー設定に求められる条件の一部を示した。 プライマー内部の二次構造形成を避け(専用ソフトの使用を推奨)、GCリッチ領域とATリッチ領域の分布バランスを取る。 4個以上の連続した同一塩基の配列や繰り返し配列を避ける。 片方のプライマー内部での3塩基以上の相補的配列を取る、もしくは1対のプライマー間での相補的配列は避ける(プライマーダイマー生成の回避)などがある。 塩基の長さを調整しながらプライマー全体のTm値を調整する。 さらに、変異導入に用いるプライマーでは、プライマーの中央部にミスマッチ部位を導入するようにデザインする。 6:PCRにおける増幅試薬の選択 PCRにおける市販増幅試薬は、1 早いPCR反応、2 ターゲットジーンがGCリッチ領域である、3 目的増幅域が数kbと長い、4 忠実度(fidelity)の高い増幅、5 クルードもしくは抽出なしのtemplateDNAを増幅する、もしくは6 multiplex-PCRなどの要因により増幅試薬が選別される。 さらに、ホットスタートの有無、master-mixの形状などの要因による場合もある。 通常使用する場合は、いくつかの増幅試薬を使い分けることで充分である。 一部の要因は別として、一般的には当初から使い分けるというよりはうまく増幅できなかった場合にたどる場合が多い。 PCRに使用する耐熱性DNAポリメラーゼは、熱水噴出皓孔に生息している耐熱菌 Thermus aquaticusが産生する高温でも比較的安定なTaq DNAポリメラーゼ(EC. 7)で通称属名の頭文字と種名を取りTaqと呼ばれ、family A(Pol I型)に分類される酵素である(現在は、遺伝子組み換え体により生産)。 近年は、PCRに使用可能な耐熱酵素の種類も多く、試薬構成も多様化しているため目的に応じた試薬が入手しやすくなった。 試薬メーカーも目的別に選択基準を提示している。 いくつかを例示すると、 『ぱっと判るPCR酵素の使い分け』(タカラバイオ社 ウェブサイト) 『PCR試薬セレクション ガイド』(ロシュ・ダイアグノスティックス社 ウェブサイト) (PDF) 『各種PCR実験に最適なPCRマスターミックス』(コスモ・バイオ社 ウェブサイト) (PDF) などがある。 この技術はLong PCRに活用されている。 酵素の添加や反応液の混和を視認できるため、操作が容易であり、さらにアガロースゲル電気泳動の動作時にローディング色素を追加する必要がなく、PCR産物の一部をアガロースゲルにそのまま添加できる。 PCRにおけるもう一つの酵素選択基準としてTAクローニングの可否がある。 A付加された増幅産物は直接TAクローニングでき増幅産物のシーケンスが容易である。 7:オリゴDNA合成依頼とプライマー使用液調製 今日では、プライマーの塩基合成(オリゴDNA合成)は多数のメーカーが行っている。 合成依頼メーカーを選定する際は、頻繁に合成を依頼している人や試薬納入ディーラーに相談する、もしくはPCR関連機器・試薬販売メーカーにオリゴDNA合成受託の有無を問い合わせるなどして決める。 価格だけにこだわることなく、製品品質の高さに重きを置くべきである。 大抵のメーカーは注文前に会員登録の手続きが必要である。 これらは、メーカーにより微妙に違いがあるため事前に確認する。 例えば、プライマーシーケンスの記述では、小文字指定、大文字指定、混合塩基、修飾塩基の記載法などである。 当初は、最小スケールの脱塩精製品でオーダーし検証すると良い。 一度、目的geneの塩基配列を打ち出し確認すると理解しやすい。 当初、戸惑うのがプライマー濃度の調製である。 粉末品の場合は溶解液(溶解液は精製水かTEとされ、TE [10 mM Tris-HCl(pH 8. 0)、1 mM EDTA]が推奨される。 水のpHは多くの場合弱酸性で、合成DNAの加水分解を引き起こす可能性があるためらしい)で目的濃度に溶解する必要がある。 以下に実例を述べる。 製品に添付された説明書に65. この場合は65. この場合は、657. この例では65. 5~2. 2~1. 5~2. 2~1. 5~2. プライマーは、通常のPCRではフォワード、リバースいずれも同濃度であるが、Multiplex-PCRではgene間で異なることがある。 しかし、同じgeneのフォワード、リバースプライマーは同濃度である。 このような場合、PCR全体の反応液量は精製水量を調製して揃える。 一般的なPCRでは、オリゴDNA合成の精製法は、脱塩で充分であるが、クローニングに用いるプライマーの場合は、最低でもカートリッジ以上のグレードが推奨される。 8:PCR条件設定 PCRの温度条件は、3段階法と2段階法とがある。 また、各ステップでの時間は使用試薬やサーマルサイクラーの機能によっても変わるが、基本的には増幅産物の鎖長によって伸長反応時間のみが変わる。 熱変性はゲノムDNAでも20秒程度で一本鎖に解離すると言われている。 通常、サイクルに入る前に2~5分間の鋳型 DNAの充分な変性時間を設定する。 サイクルごとは前サイクルのPCR産物の変性であり、その鎖長は極めて短く変性は容易である。 このときのTm値は、プライマー1対のうちの低い方を用いる。 長いプライマーを用いる場合は別であるが通常は、アニーリングの時間は30秒あれば充分である。 アニーリングの温度域でもDNAポリメラーゼ活性は作用を始め伸長反応は進んでいることも加味すべきである。 Tm値は、計算式により算出できるが合成を依頼した場合は製品説明書に付記されている。 Tm値は、反応液の塩組成によっても変わる。 目的バンドが薄い場合はアニーリングの温度を下げ、非特異バンドが出現する場合は温度を上げる。 サーモグラジェント機能があるサーマルサイクラーでは、同時に3もしくは6ポイントのアニーリング温度の条件検討ができる。 PCRの酵素は、2価の陽イオンを要求するため、PCR試薬は至適な最終濃度として1. 5~2. 5mMのマグネシウム溶液をすでに含んでいる。 非特異的な増幅産物が増えるときはマグネシウム濃度を下げる、また増幅産物の収量を増やしたい場合には濃度を上げてみる。 基本的なPCRは、(Denature-Annealing-Extension)3つの温度設定で遂行する。 従って、アニーリング温度を30秒保持している間に数100bpの伸長反応はすでに起きている。 サーマルサイクラーのAnnealing-Extension間の上昇過程でも伸長反応は進行しているが、Annealing-Extension間の移行時間は機種により異なる。 さらに、この後Extensionとして設定した伸長反応が遂行される。 このような観点からDenatureとAnnealing-Extensionを一緒にした2つの温度設定で遂行する2step(シャトル)PCRが推奨されている。 従来は、プライマーが長めでTm値が高い場合に応用されたが、近年は通常のPCRへの応用例も見られる。 但し、酵素によっては不適な場合もあるのであらかじめ検証する。 9:PCR予備テスト PCR条件が設定できたら設定条件通りに必ず一通りの予備試験を行う。 PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、目的バンドの有無、目的バンドの実測サイズと理論サイズとの一致性、非特異バンド出現の有無、プライマーダイマーの有無などを注意深く観察する。 目的バンドが検出できない場合は、PCR条件を検証する。 特にTm値の検証、アニーリング温度および変性温度は重要となる。 次に操作ミスの検証として、試薬全体の検証と添加忘れ、試薬の有無、酵素試薬の充分な活性保持(他の確実なgeneの検出)などを検証する。 次にプライマー分解の有無を確認(当初小分けした別tubeのプライマーを併用)する。 PCR条件の検証を終え、試薬・操作上の問題はないがバンドが検出できない場合はまず、増幅領域のGC含量を検証する。 (Wikipediaより抜粋) さらに、塩基配列情報からGCリッチ領域であることが判明したら、DMSO(dimethyl sulfoxide)を1~10%になるように加える。 もしくは、天然の浸透性保護剤であるベタイン(betaine)を最終濃度0. 5 ~2. 5Mとなるように加える。 これにより、GCリッチ領域の融解温度が下がる。 またPCRにおける血液やヘパリンの影響も受け難くなる。 ただし、試薬によってはすでに添加されているので確認が必要である。 PCRなどの遺伝子検査では、試薬や混合試薬量が微量なため作業中頻繁にスピンダウンが必要である。 また、タッピングしたチューブ内の試薬や水滴などはスピンダウンにより集積する。 不慣れな初期の操作では、意外に添加した試薬同士の非接触が原因で反応が進まないケースも見受けられる。 操作書をラミネートしマジックペンでチェックすれば、終了後はエタノールで拭き取ると何回も使用できる。 10:PCR増幅テストの実際 PCRなどの遺伝子増幅検査で最も留意すべき点は、増幅産物によるコンタミ対策と試料成分による増幅阻害である。 厄介なことに、これらは試料ごとに異なる現象を呈する。 増幅阻害の監視は、多くが試料中に存在する非目的遺伝子を増幅させ内部コントロールとして増幅の可否を監視する方法を取る。 一方、コンタミ対策は、積極的な防止策として、分析作業前後におけるワークステーション、ピペッターなどの使用器具、クリーンべンチなどを0. さらに、アッセイ系には陰性コントロールとして試薬コントロールや抽出系からのコントロールを用いるが検出には数的な限界がある。 また、PCRのモニターには陽性コントロールを用いる。 増幅産物の汚染対策としては、dNTP mixtureにdTTPの代わりにdUTPを用いてPCRを行う方法もある。 しかし、注意すべき点は、dUTPを使用した系では校正活性が使えないので試薬の選択には注意が必要である。 さらに、PCRに必要な試薬機器、PCR条件など万全な準備ができても回避できない課題として、多種多様な鋳型DNAが混在する試料中における低温領域でのミスマッチなアニーリングの回避がある。 プライマーの特性上、ミスアニーリングしたプライマーサイトは次回のアニーリングからは100%のマッチングを示す。 このような課題を避けるために試薬混合は氷上操作を規定しているが、これでも限界があり、目的配列以外のDNAの非特異的増幅が起きる可能性がある。 これにTaqポリメラーゼの活性が低いながらも発揮され、非特異的増幅の原因を生じる。 また、低い温度ではプライマーがダイマーやオリゴマーを形成しやすく、増幅効率の低下を招く。 このような原因からプライマーの再考が求められる場合もある。 このような反応開始時点の非特異的反応を避け、特異的な増幅の効率を高める手段の一つが、ホットスタート法である。 ホットスタート法はプライマーと鋳型DNAが低温で接合し、PCRが開始するのを防ぐ。 方法としては、1)高温下で不足しているコンポーネントを追加する方法、2) ワックスバリアー法、3) DNAポリメラーゼのモノクローナル抗体を用いる方法、4) 加熱処理をすることで活性化するTaqポリメラーゼを用いる方法などがある。 現在は、ホットスタート法の専用試薬が市販されている。 これらの試薬が入手できない場合は、試薬説明書を熟読し、必ず氷上で試薬混合操作を行い、不用な操作は極力避ける。 PCR反応液は、多くの試薬を添加することが多いので、試薬の添加順番なども気になる。 基本的には量の多い順、すなわち水、反応液(もしくはBuffer)、dNTP(反応液に加えられているものが多い)、プライマー、酵素を加え、最後にDNA(template)の順に加えるのが良い。 また、過度なタッピングやボルテックスは酵素タンパク質の失活を招く恐れがあるため避け、混和は緩やかに行う。 また、酵素液にはグリセロールなどの不凍液が添加されているので秤量の際はマイクロピペットチップへの付着に注意する。 遺伝子検査は、正しい知識の基に的確に施行しないと見えない要因に害される(図7)。 図7 遺伝子検査は適性な知識の基に的確に施行しないと見えない要因に害される 11:増幅産物の検出試験:アガロースゲル電気泳動 PCRによる増幅操作が完了したら、目的増幅産物を分子サイズ上から推測する。 機器によっては熱融解曲線(Melting curve)やTaqManプローブを用いた検出反応に即移行できるが、本稿ではアガロースゲル電気泳動による検出法を紹介する。 本作業は、PCRの可否を決定するため緊張が走ると同時にこの作業からは、膨大な量の増幅産物を含む反応液が入ったチューブを開栓し増幅産物を扱う。 従って、汚染回避策としては試薬調製や鋳型DNA調製室とは別室で作業する。 また、一つ一つの操作が増幅産物汚染の源となることを強く認識する。 当然、接触・飛散など不測の事態が生じる可能性を想定して清拭用次亜塩素酸ナトリウム液などを準備しておく。 アガロースゲル電気泳動のゲル染色法には2法がある。 一つは電気泳動後にゲルを染色し検出する方法、もう一つはゲルの中に蛍光色素を含ませ電気泳動しながら染色する方法である。 前者は、電気泳動終了後さらに染色操作が加わるため結果判読までの時間がかかる。 後者は、電気泳動の終了と同時に結果判定が可能である。 また、使用器具(LEDブルー光のトランスイルミネーターの上に透明泳動層を乗せ、オレンジフィルターで観察)によっては電気泳動しながらリアルタイムにバンド像が検出できるため染色時間を短縮できる利点がある。 しかし、前染色では、染色色素のインターカレーション(Intercalation)によりDNAの2個の塩基対間への取り込み数や部位などの差異が微妙に影響するため電気泳動像の乱れや分子サイズに相違を伴うことがある。 従って、バンドの有無の確認には良いが、正確な分子サイズを計測する場合は後染色を推奨する(臭化エチジウムはインターカレーターの代表例である)。 5に希釈しておく:通常の精製水)。 ただし、PCR試薬の説明書にバッファー指定があれば従う。 ゲルの調製量はゲルトレイの縦横を測り、ゲルの厚さ5mmをかけ計算する。 2 使用ゲルの容量が決まったら2%相当のアガロースを秤量する。 30mLのゲルを作成する場合は100mLのガラス製三角フラスコ、もしくはビーカーに0. 6gのアガロースを秤量する。 秤量したアガロースとTBEバッファーを三角フラスコに入れ、口をサランラップで覆い虫ピンで1,2箇所穴をあける(これは加熱中の蒸発防止と膨張防止のため)この状態で容器も含め全体を秤量して記録する。 3 電子レンジ(市販の安価品で充分であるが中の容器が見やすいものを選ぶ)500~750Wで加熱する。 通常は2,3分間を要するが機種により異なるため耐熱手袋を着用し突沸に注意して操作する。 通常、加熱開始から30秒位で庫内から出して軽く回転混和する。 初期沸騰を観察しながら15~30秒ごとに庫内から出して回転混和する。 沸騰を始めたら頻回に撹拌しながらアガロースの溶解状態を観察する。 微細な粒状物がなく完全に透明状に溶解したら電子レンジの加熱を止めて外に出す。 この時点で容器ごと全体を秤量し蒸発水分を計算する、重量が極端に変わっていたら蒸発した水分量にさらに0. 5~1. 0gの精製水(通常の精製水)を加え添加補正する。 補正した場合は、再度電子レンジで加熱し、一度沸騰するまで再加熱する。 水で冷却するとガラス壁に薄いゲル膜ができる)。 もし、気泡が生じたら素早くアルコールを少し離れた位置から泡にめがけ軽くスプレーする)。 5 わずかに白濁してゲル固化が確認されたら、固化ゲル上にTBEバッファーを重層した後でコームをゆっくり引き上げて外す。 泳動槽に泳動バッファー(TBE)を入れゲルトレイごとゲルを沈め、規定線まで泳動バッファーを満たす。 (もし、すぐに設置しない場合は、固化したゲル上にTBEバッファーを薄く張り乾燥を防ぐ)泳動槽にゲルを設置する場合は、ゲルトレイの底部にアガロースゲルが被膜状に付着している場合があるので設置する前にキムワイプで拭き取る。 ここまでの操作はPCR中に終えておけば、PCR終了後、すぐに検出操作に移れる。 増幅tubeの開栓時使用したグローブは、接した箇所を次亜塩素酸ナトリウム液含浸ガーゼに、次に精製水含浸ガーゼで拭いながら作業を進める。 最端ウェルに分子サイズマーカー(マーカーはラダー状:サイズの間隔と領域で選択する、DNA Digested Markers[バクテリオファージなどを制限酵素で切断したもの]とがある。 試料の分子サイズに近接したものを選ぶ)をアプライし、次のレーンから試料を注入する(各レーンにアプライした試料名を記録する)。 分子サイズを正確に知りたい場合は分子サイズマーカーを両端にアプライする。 8 アプライを終えたら100Vで電気泳動を開始する。 電気泳動槽の通電に問題がない場合は、バッファー内電極線から発泡が確認できる。 9 ニトリルグローブを着用する。 前染色した場合はそのままブルー光(480nm)を照射して、オレンジのメガネもしくはオレンジのフィルター板をかざし観察する。 染色後のアガロースゲルをプラスチックラップ上に置き、UVカット板で覆い300nmのランプを下から照射してバンドを観察する(バックグランドが濃く染まり過ぎた場合は、水、0. 過剰量は調製せず短期間であれば数回の染色に兼用できる。 EtBt染色液には次亜塩素酸ナトリウム液を加えてはならない。 処理剤としてはEtBt Destroyer(FAVORGEN Biotec社)などが市販されている。 この場合は、再度セットし電気泳動を継続する。 10 電気泳動のバンドが観察できたらまず、目的バンドと分子サイズマーカーとの相対移動距離(サンプル孔先端からバンド先端までの距離を対比する:片対数グラフを使うと便利)から分子量を推定し、目的バンドと合致しているかを確認する。 目的サイズのバンドが検出されたら一応PCR増幅は成功したといえる。 しかし、この他に非特異バンドの出現や多くのプライマーダイマーが出現した場合は、PCR条件の再考が必要となる。 観察後は、記録のためにデジカメや、iPhoneもしくは専用の写真撮影装置を使ってアガロースゲルのバンド写真を撮影する。 この場合、使用した蛍光色素によりフィルターが異なるので事前に適不適を調べておく。 11 PCR検査の汚染は、増幅後のチューブ開栓が必要な検出検査中に発生することが多い。 不要な増幅チューブの開栓や増幅産物の採取は避け、もし操作中に誤ってテーブルに滴下・飛散した場合や他の器具に触れたときなどは、速やかに0. 5%次亜塩素酸ナトリウム液で予想よりも広範囲を丁寧に清拭し、その後を数回水拭き(水道水)する。 12 撮影を終え、その後の操作がなく不要となったアガロースゲルは、敷いていたプラスチックラップでゲルを包み、着用している片方のニトリルグローブの掌側に載せ、グローブを裏返しに脱ぎながら包み込む、脱ぎ終えたらグローブの手首側を結んで封入し、さらにもう片方のグローブで覆い封入する。 高熱焼却処理する廃棄物として廃棄する。 電気泳動に使用した緩衝液もそのまま廃棄せず、大きめの蓋付タッパーに入れ(泳動槽も少量の水道水で2,3回共洗いし一緒にためる)0. 05~0. 50%相当の次亜塩素酸ナトリウムを入れ、蓋をしてよく混合し室温で30~60分間ほど置いてから水道水を流しながら周りに飛散しないように廃棄する。 使用したマイクロピペットチップやチューブなどは0. 05~0. これらの操作は、PCR増幅産物による汚染防止の作業のため改良や工夫が必要である。 また、作業を終えた後の作業箇所や使用器具の清拭も作業工程の一つと認識すべきである。 まとめ 遺伝子検査は、初心者でも知っておくべき知識が多く、また、知識は多いに越したことはない。 はじめて遭遇する分野であってもそのような分野の知識が必要となってきたこと自体が自らの進歩であることを憂い闊歩していただきたい。 遺伝子検査は、ルーチン検査に流されるだけでなくわずかなバンドサイズの違いを見過ごさない、もしくは手持ち機器を最大限に活用するなど各人の意欲に委ねられる点が大きい。 その分、わずかな違和感から重要な糸口を引き出せる可能性も秘めている。 まだまだ潜む発見の可能性を見つけ出す視点を養ってほしい。 本稿を読んで遺伝子検査の利点・欠点を少しでも学んでいただき、可能な範疇において応用範囲を広げられたとき、一歩前進した知識を獲得されたものと喜びを分ちたい。

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12. これからPCR検査を始めたい方への基礎知識

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理想的なリアルタイムPCR解析を実行するには、最適化によって反応のすべてのパラメータをきめ細かく調整し、正確な結果が確実に得られるようにすることが必要です。 新しい遺伝子の研究を始める場合、または解析のパラメータを変更する場合には常に、必要なすべての反応調整を含む解析の検証を行う必要があります。 具体的にはプライマー濃度、サーマルサイクリングの温度および時間の調整、そして標準曲線評価によるパラメータの確認などです。 最適化には時間がかかりますが、時間をかけるだけの価値はあります。 なぜなら、最適化は解析の最高の感度とダイナミックレンジ、高い効率(高精度につながります)および非常に優れた再現性の獲得につながるからです。 これらの因子はすべてデータの信頼度につながり、最終的には研究コミュニティーに受け入れられ得る実験結果につながります。 リアルタイムPCRのトラブルシューティングは、非常に困難であるように感じられるかもしれません。 しかし、正しい解析デザインが考慮されていると仮定した場合、一般的なリアルタイムPCRの問題点は、以下の4つの大きな範囲にグループ分けすることが可能です。 プライマーダイマーの形成• プライマーおよびプローブの保存• リアルタイムPCR阻害および反応効率の低下• プライマーダイマーの形成 プライマーダイマーは、プライマーペアの間に部分的な配列の相同性が存在する場合に形成されます。 PCR反応中にプライマー同士がアニールすると、Taq DNAポリメラーゼによる伸長が起こり、本来のプライマーよりもサイズが大きく、しかもサイクルが進むにつれて誤ったアニーリングをより起こしやすくなる産物を生成する可能性があります。 プライマーの長さによっては、プライマー自体が折り畳まれることによりテンプレートとの競合環境を作り出してしまう可能性もあります。 特にマルチプレックス反応のような複雑な反応系では、これらの望ましくない反応が発生する機会が増加します。 プライマーダイマーの形成は、リアルタイムPCRのデザインおよび検証において解決しなくてはならない最も一般的な問題の一つですが、リアルタイムPCR反応からこれらの問題を取り除く方法は多数存在します。 プライマーダイマーの問題をどのようにして解決するかをご紹介する前に、先ずなぜダイマー形成を最小限に抑えることあるいは低減させることが必要であるかを理解することが重要です。 プライマーダイマーに起因する問題 プライマーダイマーが反応に与える影響は、使用するケミストリにより大きく異なります。 蛍光プローブを使用する反応はプライマーダイマーによる影響をあまり受けない傾向にありますが、これはプライマーダイマー領域におけるプローブのアニーリングおよび切断がほとんど起こらないためです。 この場合には、プライマーへの競合が考慮すべき主要因子となります。 一方、二本鎖DNA結合色素を利用する反応は、プライマーダイマーが存在しない条件に大きく依存していますが、これは色素がプライマーダイマーに非特異的に結合する可能性があり、その蛍光が反応中にモニターされる蛍光量に影響を及ぼしてしまうためです。 これによってCtがシフトし、解析結果を歪めてしまいます。 外来性のシグナルは最も重要な因子ですが、反応ウェル内の競合も反応効率に直接影響を及ぼします。 前述したように、反応効率が低いとダイナミックレンジが狭められ、結果として感度が低下します。 そもそも二量体形成が起こらないようにするために、プライマーデザインの段階において簡単な予防策を講じることが最良の方法です。 そのための無料ツールがいくつか入手可能です。 そのようなツールの一例がAutoDimer(米国国立標準技術研究所のP. Vallone 著)で、プライマーペアの配列を解析し、理論的に二量体形成を起こし易いプアリマーペアに警告を出します。 バイオインフォマティクスを利用したプライマーデザインにより、二量体形成の可能性を低減させることが可能ですが、二量体形成を実験的にモニターすることはやはり必要です。 プライマーダイマーの有無の決定 ゲル電気泳動法によりプライマーダイマーを目視で確認することができます。 プライマーダイマーは、通常100塩基対よりも短いサイズの広がったバンドとして確認できます(図1)。 PCR反応においては、ダイマー形成とテンプレートのアニーリングおよび伸長が競合します。 テンプレートが減少するにつれて、プライマーダイマーが増幅しやすくなります。 ゲル電気泳動法を唯一の検証方法として使用することの欠点は、感度がナノグラム領域であるため結果が不確実になる可能性があることです。 ゲル電気泳動法の長所は、温度解離曲線(融解曲線)データが存在する場合、反応産物のサイズの把握が全体的解釈する際に有用となることです。 図1 アガロースゲル解析によるプライマーダイマーの確認。 DNAサンプルを段階希釈し、サーマルサイクリング反応を行いました。 終了後の反応液を等量ずつアガロースゲル電気泳動に流しました。 プライマーダイマーは100bp未満の領域の広がったバンドとして確認できました。 また、核酸サンプル量が少なくなるにつれ、プライマーダイマー量が増えることも確認できました。 解離曲線は、融解曲線とも称され、二本鎖DNA結合色素を使用する反応の標準的な熱的分析手法です。 非常に特異性が高く増幅した場合は、リアルタイムPCRプレート上の各ウェルに関する融解曲線において1本の幅の狭いピークが確認できます。 このピークの形とTm値の特徴は、プライマーダイマーのサイズが小さく、しかも一定していないことに起因しています。 データ解析の項で示したように、融解曲線においてプライマーダイマーの存在が疑われる場合には常に、NTCウェルとの比較を行ってください。 テンプレートが存在しない場合にプライマーダイマーが最も形成されやすいです(図2)。 図2 (A)特異的増幅および(B)プライマーダイマーの影響を示す、増幅プロットおよび融解プロファイル。 プライマーダイマーは(B)において増幅曲線中のNTCにより生成されたシグナルおよび融解プロファイル中の追加ピークとして同定されます。 プライマーダイマーの低減または排除 プライマーダイマーが問題となる場合、反応におけるプライマーダイマーの生成を低減または排除するためにいくつかの方法があります。 第一の方法はサーマルサイクル条件の最適化ですが、これには主としてアニーリング温度の上昇が行われます。 プライマー濃度を下げることも可能です。 さらに、フォワードプライマーとリバースプライマーの比を変化させることが有用となる場合もあります。 ほとんどの場合、各プライマーの最終濃度として200nMが理想的ですが、必要であれば60nM程度に低下させることも可能です。 マグネシウム濃度は約3mMが最適です。 これ以上の濃度ではプライマーダイマーが生成しやすくなります。 プライマーダイマーが形成されるかどうか評価されていなかった場合には、評価を行い、必要であればプライマーデザインの変更を検討してください。 通常、ホットスタートDNAポリメラーゼの使用および、反応のセットアップを氷上で行うことが望ましいです。 理想的には、同一のターゲットに関して複数のプライマーセットを同時に試験することが必要です。 実際この方法により直ちに使用可能なプライマーペアが見つけられれば、最適化に費やす多くの時間を節約することが可能となります。 1-Step qRT-PCR反応では、プライマーセットが存在する状態で、低温でのRT反応を行うため、プライマーダイマーが増幅する危険性が高くなり、より一層の注意が必要です。 一方で、プライマーダイマーが問題とならない場合もあります。 例えば、プライマーダイマーがNTCウェルにしか現れない場合や、サンプルとNTCウェルのCt 値の差が10以上の場合です(プライマーダイマーの蛍光による全体的なシグナルへの影響がごくわずかなため)。 プライマーおよびプローブの保存 プライマーおよびプローブの保存条件は、見過ごされることが多い要因ですが、リアルタイムPCR解析の長期的な成功および一貫性に大きな影響を与える可能性があります。 プライマーおよびプローブの安定性に影響を与える主な要因は、保存温度、保存期間、長期間にわたる光への曝露の有無、プライマーおよびプローブの保存濃度および保存溶液の成分です。 プライマーおよびプローブの不適切な保存に起因する問題 プライマーおよびプローブを不適切に保存すると、分解および特異性が消失する可能性があり、結果として反応効率に影響を与えます。 蛍光標識したプライマーおよびプローブに依存する解析においては、分解したプローブが遊離の色素を放出し、バックグラウンドが上昇してシグナルとノイズの比が低下します。 このため、蛍光強度が低くなり非常に精度の低い増幅曲線になる可能性があります。 プライマーおよびプローブに結合した蛍光色素は、時間経過とともに退色する可能性があり、リアルタイムPCR装置により検出されにくくなります。 プライマーまたはプローブの品質の低下の検出 プライマーおよびプローブの安定性を保持するための第一の防御法は、簡単な保存時間のモニターを行うことです。 多くの場合、プライマーおよびプローブは、1年間(あるいはそれ以上)は安定です。 しかし、保存条件が最適でない場合には、保存条件に関連した影響が6ヵ月以内にあらわれることもあります。 プライマーの品質を評価する最も適切な方法は、増幅曲線を定期的に作成する方法です。 反復の不正確さおよび融解曲線における複数ピークがみられる場合、特に以前にそれらの現象がみられていない場合には、安定性が低くなっていることの一般的な兆侯といえます。 蛍光標識されたプローブおよびプライマーの場合には、装置のマルチコンポーネントビュー上の蛍光バックグラウンドの値が正常より高い場合に、プローブの分解が示唆されます。 蛍光標識したプローブまたはプライマーが分解していない場合でも、蛍光色素自体が分解している場合には、反応産物がエチジウムブロマイドで染色したゲルで確認できますが、リアルタイムPCR装置では検出されません。 図3には、保存条件が適切でないプライマーの影響を表わす増幅曲線が示されています。 図3Aの増幅プロットは分解したプライマーによる負の影響を受けており、図3Bの曲線は適切に保存されたプライマーを用いた良好な結果を示しています。 融解曲線からはさらに詳細が明らかとなり、複数の非特異的産物が存在していることが示されています。 図3 保存が不適切だったプライマーの影響を示す。 増幅プロット(融解曲線および蛍光バックグラウンドにより示されています)(A) vs. 適切に保存されたプライマー(B) プライマーおよびプローブの長期にわたる安定性の維持 プライマーおよびプローブの安定性の維持するためには4つの重要点があります。 凍結乾燥されたプライマーは保存時間および保存温度に関してより長期に安定です。 標識したプライマーおよびプローブに関しては標識を光から保護することにより(不透明なチューブの使用および暗所での保存など)長期保存することができます。 さらに、プライマー濃度も安定性に影響を与える可能性があります。 プライマーおよびプローブは、特に標識されている場合には分注して保存し凍結・融解サイクルを最小限に抑えることが必要です。 最後にTE緩衝液は水よりも安定的な環境です。 さらに、0. 1mM EDTAを含むTE緩衝液は(標準的なTE緩衝液に含まれる濃度である1mM EDTAと比較して)、より良い選択です。 これはいくつかのPCR反応では、残留するEDTAの影響を受けやすいためです。 テンプレート無しコントロール(NTC)での増幅 前の項で述べたように、2本鎖DNAに結合する色素を使用するとプライマーダイマーが生じた場合にはテンプレート無しの反応においても増幅シグナルが検出される可能性があります。 しかし、それ以外の場合でもテンプレート無しのウェルで増幅がみられる場合があります。 プローブを用いた反応でも、2本鎖DNA結合性の色素を用いた反応でも、コンタミネーションによってサイクルの後半に遅れて増幅が起こることがあります。 テンプレート無しコントロールウェルのすべてで増幅が起こるわけではなくこのような現象がランダムにおこる場合、ピペッティングエラーが原因の可能性があります。 一方、すべてのテンプレート無しコントロールウェルで増幅が見られる場合には、使用した試薬のいずれかがコンタミネーションしている可能性が高いと考えられます。 清潔な作業スペースを使用します。 作業台の表面をきれいに拭き取り、必要に応じて核酸を分解する試薬を使用します。 以前に実施したPCR反応からのコンタミネーションを避けるため、dUTPとUDGを含むマスターミックスを使用します。 そうすれば以前の反応から混入したPCR産物は分解除去できます。 どの試薬に問題があるかどうかを確認するため、可能なら新しい試薬チューブもしくは由来が異なる試薬と入れ替えます。 可能なら、別の場所で反応のセットアップを行います。 これは特に非常に拡散しやすく、その除去が困難なプラスミドのコントロールを使用している場合に有効です。 PCR阻害物質および反応効率の低下 ここまでの説明により、リアルタイムPCRのアッセイデザインおよび最適化の重要な要因の中における反応効率の重要性はすでに十分に理解されていると思われます。 もう一度見直しておくと、反応効率の算出には検量線(ターゲットテンプレートの段階希釈試料から作成されたもの)を用います。 この反応効率の値は、反応全体の「正確性」のマーカーとしての機能を果たします。 効率が低いときと高いときでは異なる結果になります。 このような状況を改善するための方法は極めて多様です。 高効率または低効率の要因 反応効率が110%を超える場合は反応に阻害が存在することを示しています。 阻害の要因には、低品質のRNAまたはDNA、高濃度のテンプレートおよび核酸精製の残留物などがあります。 例えば、シリカカラムが使用された場合、DNAまたはRNAを抽出させるために使用したカオトロピック塩がTaq DNAポリメラーゼを阻害する可能性があります。 有機溶媒抽出を使用した場合には、残留するフェノールおよびエタノールが同様の効果をもたらす可能性があります。 通常、阻害は反応効率が90%以下になる要因として一般的ではありません。 効率の低下の要因には最適化されていない試薬濃度(主にプライマー、マグネシウム、そして特にマルチプレックス実験においてはTaq DNAポリメラーゼ)などがあげられます。 前述したように、チューブ中での競合は反応効率が低くなる原因となります。 ターゲットの効率が高い場合においてもあるいは低い場合においても、ターゲットとノーマライザーの効率を合致させることが、データの精度を維持するためには非常に重要です。 さらに、阻害および効率の低下もアッセイの感度に影響を与え、ダイナミックレンジが縮小し、汎用性が低下する可能性があります(図4)。 図4 反応効率を評価するためのテンプレートの段階希釈。 早いCt 値を示す希釈物においてはCt値が互いに接近しており、曲線は異常な形状を示しています。 テンプレートがより希釈されるにつれて阻害の影響がなくなり、曲線は特徴的な指数関数的形状相により近くなります。 効率の歪みの同定 前述したとおり、特定のアッセイが非効率的であるかどうかを同定するための最良の方法は、未知試料において期待される濃度範囲において希釈されたテンプレートの標準曲線を作成し、その範囲における効率を観察することです。 融解曲線またはゲル電気泳動法において複数のピークが観察される場合には、反応中で競合していることが示され、その競合が確実に反応効率に影響を与えています。 効率の低下または阻害の解決 反応が阻害されていること、または反応の効率が低下していることが判明した場合に、効率を望ましい範囲に戻すいくつかの方法があります。 阻害に関しては、テンプレートの濃度が最も高いウェルを除いて検量線を解析し直すことができます。 但し、検量線から除いた濃度はすべて実際のアッセイには使用しないように注意してください。 もう一つの解決法として、テンプレートの再精製があります。 その際には、エタノール沈殿由来のエタノールを除去するために乾燥時間を長くすること、またはシリカベースの精製由来のカオトロピック塩を除去するためにカラム上での精製を追加することを忘れないでください。 効率の低下に対してはアッセイの最適化によって解決することが可能です。 その過程は比較的簡単な場合もありますが、場合によってはアッセイの複雑性が増すにつれて最適化が煩雑になる可能性もあります。 単一の産物のみが増幅される場合には、マグネシウム濃度を6mMにまで上昇させることにより効率を改善することが可能ですが、競合が存在する場合にはマグネシウム濃度を低下させることが効果的である可能性もあります。 主としてマルチプレックス反応においては、プライマーおよびプローブの最適化マトリックスが必要となる場合があります。 この場合、特定のアッセイに関する理想的な濃度の組み合わせを見つけるために、フォワードプライマーとリバースプライマーの様々な比、そして時には異なるプローブ比を試験します。 理想的なプライマー濃度は100nM~600nMの範囲であり、理想的なプローブ濃度は100nM~400nMの間です。 サーマルサイクリングの条件(特にアニーリング温度)がプライマーのTmに関して好適であり、プライマー同士が同様なTmを有するようにデザインされていることを確認してください。 反応に関連しているように見られる問題が実際はソフトウェア関連の問題であるという場合も存在します。 ソフトウェアの設定を検証あるいは最適化することにより期待に沿う結果が得られるケースもしばしば存在します。 ソフトウェア解析設定 先に述べたように、解析により良好なアッセイが表示されなくなっている可能性が存在する場合もあります。 データの精度に最も大きな役割を果たす解析設定は以下のとおりです。 増幅曲線ベースラインの直線性• ベースラインレンジ設定• Threshold Lineの設定• レファレンス色素 増幅曲線ベースラインの直線性は、結果に影響を与える可能性のあるパラメータの一つです。 装置ソフトウェアは一般的に、増幅曲線の平らな部分(蛍光の増幅がみられない部分)を自動的にベースラインとして設定します。 しかし、ノーマライザーとして18 Sを使用する場合のように、Ct が非常に早い場合には、すでに平らではない部分が誤ってベースラインに含まれてしまう可能性があります。 図5にはベースライン設定を変化させた同一のプロットです。 図5Aには、サイクル1からサイクル14のベースラインによるプロットを示していますが、蛍光は10サイクル目から検出されているため、この設定は幅が広すぎます。 その結果として曲線が沈みCt が遅くなります。 図5Bは、ベースラインをサイクル2からサイクル8の範囲にリセットした結果を示していますが、曲線およびCt値は正確な位置に戻っています。 図6 許容可能な反応効率を獲得するためのベースライン設定法の比較。 (AおよびD)これらのプロットにおけるベースラインは手動により非常に広く設定されており、検量線の傾きは—2. 81 で、好ましい範囲である—3. 58 から—3. (CおよびF)ここにはAおよびDと同一の曲線が示されていますが、ベースラインは装置により自動的に選択されたものです。 傾きは理想的な範囲内にあり、アッセイはこのダイナミックレンジにわたって検証されています。 Threshold Line の設定(バックグラウンドを超える蛍光レベルで、Ct 決定のために使用される値)はソフトウェアにより自動的に設定されるもう一つのパラメータですが、これも手動で調整することが可能です。 同一のランで複数のキットまたはケミストリを評価する際に、しばしば手動での調整が必要となります。 ソフトウェアは自動的に、より高いプラトーを有する曲線(図7の青色のプロット)に理想的なThresholdを設定します。 しかし赤色のプロットに関する理想的なThresholdはさらに低い値であるため、この結果は同一のデータセット中の赤色のプロットのCtにバイアスをかけます。 このため、各データセットを別々に解析し、各状況に応じて理想的なThresholdを選択することが必要です。 図7 対数プロットのスクリーンショット。 プラトーの高さの異なる、すなわち異なる指数対数的増幅期を有する2セットの増幅曲線の例が示されています。 増幅曲線において、Ct 決定のために最も正確な部分は対数プロットにおける指数関数的増幅期のちょうど真中に当たります。 理想的な閾値の設定は各データセットによって異なることもあります。 また、初期設定で多くの場合極めて適切な位置に設定されますが、必要に応じてさらに精度を向上させるために、Thresholdを指数関数的増幅期の真中に手動で設定することも可能です。 検量線のダイナミックレンジの検証により、アッセイ毎に許容可能なテンプレート濃度が決定されます。 検量線の最高または最低濃度が実際の解析において使用されない場合に限り、反応効率を向上させるためにこれらの濃度を排除することも可能です(図8)。 一般的に、効率が低下する場合にはいつでも両端のデータポイントを排除することが可能であるため、非常に高いテンプレートから非常に低いテンプレートまで検出限界を広げておくのもよいでしょう。 図8 異常値を排除することにより達成された検量線の傾きの改善。 5桁にわたる段階希釈に関して増幅反応を行いました。 この範囲において、傾きは—2. 9であり、好ましい効率の範囲から外れています。 下段の曲線では、検量線から希釈度の最も高い点を排除して効率を再解析しました。 傾きは—3. 1に改善し、アッセイを検証するために十分な効率であると考えられます。 ROXおよびフルオレセインなどのレファレンス色素の使用は、装置およびユーザーに起因するエラーの影響を排除するための強力な方法です。 レファレンス色素の使用は非常に一般的になっているため、この「舞台裏の」因子は、多くの場合忘れられたり、反応に負の影響を与えることはないとみなされたりしています。 しかし、装置と色素自体の関係を理解しておくことは重要です。 レファレンス色素を使用する装置においては、ソフトウェアにより不活性色素のシグナルがターゲットの発する蛍光から差し引かれます。 このため、例えばROXのレベルが高すぎる場合には、得られるターゲットシグナルが非常に低くなり、波状で一貫性のない増幅プロットを与えます(図9A)。 一見したところ、反応が失敗し、多くの最適化が必要であるように思われますが、いったいどこから始めればよいのでしょうか? しかし、ノーマライザーとしてのROXチャネルのスイッチを切り、データを再解析すると、実際のところデータは適切であることがわかります(図9B)。 つまりレファレンス色素の標準化の問題であることがわかります。 図9 レファレンス色素に関する補正。 (A) ROXなどのパッシブレファレンス色素のレベルが高い場合、ターゲットのシグナルが低くなります。 (B)ROXのシグナルを解析から除去すると、ターゲットシグナルは期待される範囲に収まります。 前述したとおり、装置ソフトウェアの設定はほとんどの場合適切に行われます。 しかし、これらの設定を検証することによりデータの精度の信頼度をさらに向上することができます。 ソフトウェアによって選択されたベースラインが増幅曲線の平らな範囲のみにあることを確認し、必要に応じてベースラインのレンジを増加または減少させてください。 増幅曲線を対数プロットで観察し、Threshold が指数関数的増幅期の真中付近にあることを確認してください。 y軸を蛍光プラトー強度に対して適切にスケール化し、異常値を標準曲線から排除して効率およびR2 値を改善することが可能であることに留意してください(これらの希釈が「未知」試料の評価に使用されていない場合に限ります)。 最後に、比較を行うアッセイ間では、ベースラインおよびThreshold の設定が同一であることが必要な点に留意してください。 トラブルシューティングは、リアルタイムPCRアッセイの検証および使用において避けることのできない問題です。 しかし、以下のように重要点を整理して理解することにより、比較的簡単なプロセスとすることが可能です。 プライマーダイマーがシグナルまたは反応効率の低下に影響していないことを確認してください。 プライマーおよびプローブの安定性を維持するのに必要な対策を講じてください。 反応評価の最終段階として検量線を作成してください。 必要に応じて装置の解析設定を検証し調整してください。 増幅しない アッセイによっては、全く増幅しない問題が発生することがあります。 これまでにご説明したすべてのステップを行っても増幅しない場合、発現量が少ない、逆転写の問題、アッセイデザインの問題など、その他の要因で増幅していない可能性があります。 発現量が少ない 遺伝子発現解析を行う際には1-100 ng のcDNAを用いるのが一般的です。 しかし、調べたい遺伝子の発現量が低い場合には使用量をもっと増やす必要があります。 この場合、使用できる上限量までの範囲内で、cDNA使用量を振って反応します。 アッセイがきちんと機能していることを確認するために、ポジティブコントロールサンプルも同時に反応するのが理想的です。 どの程度の発現量であるか不明な場合には、文献をご参照いただくか、NCBI UnigeneデータベースのESTの発現データから異なる組織の発現量比をご参照いただくことができます。 逆転写に関する問題がある 低発現に関連しますが、サンプル中の目的遺伝子が低発現の場合には、アッセイの感度を上げる必要があるかもしれません。 使用するcDNAが多すぎると、反応液により多くの阻害物質が混入し、反応の効率を低下させる可能性があります。 また使用する逆転写酵素とプライマーのタイプをチェックすることも有効かもしれません。 一般に逆転写プライマーはoligo(dT)よりもランダムプライマーを使用する方が収量は多くなります。 また、 のような遺伝子工学によって熱に対する安定性が強化されている酵素は、収量の改善に有効です。 反応試薬のすべてについて、増幅効率を高める方向に最適化されているかどうかをチェックします。 NCBIなどの配列データベースで目的遺伝子のバリアントについてチェックします。 そのアッセイが、使用しているサンプルでは発現していない、あるいは複数バリアントのうちの1種類だけを検出するようなデザインである可能性もあるからです。 同様に、イントロン配列をターゲットとするようなアッセイはcDNAサンプルを用いた場合、増幅が起こらないと考えられます。 リアルタイムPCRハンドブック 無料ダウンロード このハンドブックでは、リアルタイムPCRの理論や実験デザインの設計など、リアルタイムPCRの基礎知識が掲載されています。 リアルタイムPCRを始めたばかりの方やこれから実験を考えている方にうってつけのハンドブックです。 PDFファイルのダウンロードをご希望の方は、下記ボタンよりお申し込みください。 研究用にのみ使用できます。 診断目的およびその手続き上での使用はできません。

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